大家好！今天跟大家分享的文献是2021年1月发表在Journal of Translational Medicine （IF=4.124）杂志上的一篇文章。文章利用TCGA数据库中发生和未发生KRAS突变的结直肠癌患者的转录组数据，分析患者的免疫情况并构建Imm-R模型。题目：Immune landscape and prognostic immune-related genes in KRAS-mutant colorectal cancer patients
发生KRAS突变结直肠癌患者的免疫情况和预后免疫相关基因
背景：KRAS突变是结直肠癌最常见的突变类型。KRAS突变介导的CRC免疫表型和免疫通路调控尚待阐明。
方法：比较KRAS突变型和野生型患者肿瘤微环境中免疫相关基因（IRG）的表达情况和肿瘤浸润免疫细胞（TIIC）的丰度并使用验证集进行验证。使用335名CRC患者的数据分析KRAS突变对全身免疫和炎症状态的影响。建立并验证了由IRG和TIIC组成的免疫风险模型，预测KRAS突变CRC患者的预后。
结果：发生KRAS突变的CRC患者，NK-κB和T细胞受体信号通路受到显著抑制，调节性T细胞（Tregs）增加而巨噬细胞M1和活化CD4记忆T细胞减少。预后与Tregs，巨噬细胞M1和活化的CD4记忆T细胞有关。与未发生KRAS突变的CRC患者相比，发生KRAS突变的CRC患者的血清超敏C反应蛋白（hs-CRP），CRP和IgM水平显著降低。使用免疫风险模型对CRC患者进行分类。
结论：CRC患者的KRAS突变与免疫通路抑制和免疫浸润有关。异常的免疫通路和免疫细胞有助于了解发生KRAS突变的CRC患者的肿瘤免疫微环境。
分析535名CRC患者的体细胞突变情况，其中有99.63%的患者都发生了基因突变。有79%的患者发生APC突变，61%的患者发生TP53突变，42%的患者发生KRAS突变。根据是否发生KRAS突变，将患者分为两组。发生KRAS突变的患者中，发生APC，TP53和PIK3CA突变的频率最高，APC和PIK3CA的突变频率显著增加。在未发生KRAS突变的患者中，发生APC,TP53和SYME1突变的频率最高，TP53和ZFHX4的突变频率显著增加（图1a和1b）。GSEA分析发现，发生KRAS突变的患者中，免疫相关的通路显著下调，氨基酸生物合成，碳代谢等通路显著上调（图1c）。以上结果表明，发生KRAS突变的CRC患者的免疫功能受到抑制。PD-1等免疫检查点分子的表达使免疫治疗反应的预测因素之一。发生KRAS突变的CRC患者的免疫检查点分子显著下调（图1d）。因此，KRAS突变可能会抑制免疫检查点分子。
图1 结直肠癌患者的体细胞突变情况
2. CRC患者的免疫情况
分析528名CRC患者的免疫情况，发现TIIC比例存在明显差异（图2a）。因此，TIIC比例可以代表个体差异的特征。相关性分析揭示了不同免疫细胞亚群的正相关情况（图2b）。CRC患者不同类型免疫细胞丰度情况见图2c。发生KRAS突变的CRC患者中B细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞的丰度显著降低。作者使用CIBERSORT对免疫细胞进行进一步分型，发现发生KRAS突变的患者天然B细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞M1显著下调而调节性T细胞（Tregs）显著增加（图2d）。去除72例发生MSI-H或dMMR的CRC患者，重新分析两组患者的免疫微环境。作者发现，天然B细胞、巨噬细胞M1、活化CD4记忆T细胞和Tregs存在显著差异。
图2 CRC患者的免疫情况
3. 肿瘤浸润免疫细胞（TIIC）特征的开发和验证
对差异TIICs进行生存分析，发现发生KRAS突变的患者中高丰度的巨噬细胞M1和CD4记忆T细胞与预后较好有关而高丰度Tregs与预后较差有关，B细胞和中性粒细胞与预后没有显著相关性（图3a）。使用验证集GSE39582进行验证，结果表明巨噬细胞M1和CD4记忆T细胞与预后较好有关，高丰度的Tregs与预后较差有关（图3b）。在未发生KRAS突变的患者中，巨噬细胞M1与生存率显著相关。这些结果表明发生KRAS突变的患者中巨噬细胞M1，CD4记忆T细胞和Tregs的预后价值更高。多因素Cox回归分析表明巨噬细胞M1，CD4记忆T细胞和Treg是发生KRAS突变的患者的独立预后TIIC。根据TIICs特征构建TIICs特征打分方法。根据TIICs打分将发生KRAS突变的CRC患者分为高风险和低风险组，高风险组的总生存期较差（图3c）。验证集中，高风险组的OS较差（图3d）。训练集和验证集OS的ROC曲线的AUC分别为0.75和0.68（图3e）。
图3 肿瘤浸润免疫细胞特征的开发和验证
4. 发生KRAS突变和未发生KRAS突变的CRC患者的差异表达的IRGs
使用edgeR共鉴定到73个差异表达IRG，富集分析发现神经活性配体-受体相互作用，细胞因子-细胞因子受体互作和Ras信号等通路显著富集，受体配体活性等功能显著富集。这些结果表明差异表达IRG与信号转导有关。单因素Cox回归分析表明有13个差异表达IRG与OS显著相关（图4a），其中有12个是预后不良的危险因素。多因素Cox回归分析得到三个独立预后因子VGF，RLN3和CT45A1。通过多因素Cox回归分析得到的独立预后因子和TIICs构建免疫风险（Imm-R）模型（图4b），免疫风险打分计算方法如下：免疫打分=0.165×VGF+0.453×RLN3+0.203×CT45A1+0.372×TIICs特征。根据Imm-R模型可以区分预后良好和预后不良的发生KRAS突变的患者（图4c），高危组患者生存期短。Imm-R模型在验证集中表现良好，高危组OS显著低于低危组（图4d）。训练集和验证集ROC曲线的AUC分别为0.76和0.68（图4e）。列线图结果见图4f，使用校准图比较预测的三年和五年生存率与实际三年和五年生存率（图4g和4h），一致性较好。这些结果表明Imm-R模型效果良好。
图4 Imm-R模型的开发和验证
6. 免疫浸润和Imm-R模型的关系
高危组的B细胞，Tregs，巨噬细胞M0和肥大细胞的丰度显著增加，CD8+T细胞，CD4记忆T细胞，滤泡辅助性T细胞，巨噬细胞M1和M2等细胞显著降低（图5a）。GSEA分析发现高危组中与癌症或代谢相关的通路显著激活，反应高危组的肿瘤代谢活跃（图5b），与免疫相关的通路显著下调（图5c）。
图5 Imm-R模型与免疫浸润的关系
7. 发生KRAS突变的CRC患者的全身免疫和炎症状态
通过比较335例CRC患者学业中免疫细胞，Igs，血小板等水平评估局部肿瘤组织中异常免疫浸润状态。未发生KRAS突变的患者中发生远处转移的患者比例更高，发生KRAS突变的患者的CRP和IgM水平显著降低。两组患者的白细胞，嗜中性粒细胞，淋巴细胞等细胞数量相似。
本研究系统的揭示了发生KRAS突变和未发生KRAS突变的CRC患者的免疫情况和IRGs。发生KRAS突变的患者与抑制免疫通路和免疫浸润有关，并通过TIICs和IRGs构建Imm-R模型。本文的亮点在于构建Imm-R模型预测CRC患者的预后情况，得到了较好的预测效果且使用外部数据进行了验证。
